1. Cellerna som ska kryokonserveras bör vara i ett tillstånd av god tillväxt (logfas) och hög överlevnadsgrad, med en densitet på cirka 80-90%.
2. Kontrollera om cellerna fortfarande behåller sina unika egenskaper innan de fryses.
Till exempel bör hybridom testas för antikroppsproduktion en till två dagar före kryokonservering.
3. Var uppmärksam på kvaliteten på kryoskyddsmedlet.
DMSO bör vara av reagenskvalitet, steril och färglös (filtrerad med 0,22 mikron FGLP Telflon eller direktköpta sterila produkter, såsom Sigma D-2650), uppdelad i små volymer om 5-10 ml, förvarad vid 4 oC i mörker. Tina inte upp flera gånger. Glycerol bör också vara av reagenskvalitet och förvaras mörkt efter autoklavering. Använd inom ett år efter öppnande, eftersom det kommer att vara giftigt för celler efter långtidsförvaring.
4. Cellkoncentration för kryokonservering:
(1) Normal human fibroblast: 1~3 x 106 celler/ml
(2) Hybridom: 1~3 x 106 celler/ml, cellkoncentrationen bör inte vara för hög, vissa hybridom kommer att dö efter upptining 24 timmar på grund av den höga fryskoncentrationen.
(3) Vidhäftande tumörlinjer: 5~7 x 106, beroende på celltyp. Adenocarcinom kräver en högre koncentration efter upptining, medan HeLa endast behöver 1-3 x 106 celler/ml.
(4) andra suspensioner: 5~10 x 106 celler/ml, human lymfocyt måste vara minst 5 x 106 celler/ml.
5. Koncentrationen av kryoskyddsmedel är 5 eller 10 % DMSO. Om frysförhållandena för cellerna är osäkra, bör en reservkultur användas under kryokonservering för att förhindra frysningsfel.
6. Infrysningsmetod:
(1) Traditionell metod: 4 oC 10 minuter ---> -20 oC 30 minuter ---> -80 oC 16-18 timmar (eller över natten) ---> Långtidslagring i ångfasen av tanken med flytande kväve .
(2) Programkylning: Använd en kylmaskin med konstant hastighet för att sänka från rumstemperatur till –120 oC med en hastighet av –1 ~ -3 oC/min och förvara den i ångfasen i en tank med flytande kväve under lång tid. tidslagring. Det är lämpligt för bevarande av suspensionsceller och hybridom.
7. Material:
(1) Odlade celler som växer bra
(2) Färskt medium
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Sterilt kryokonserveringsrör av plast (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4 % vikt/volym trypanblått (GibcoBRL 15250-061)
(6) Hemocytometerplatta och täckglas
(7) Kylmaskin med konstant hastighet (KRYO 10 Series II)
8. Steg:
(1) Byt halva eller hela mängden medium en dag före frysning och observera celltillväxt.
(2) Beredning av kryokonserveringslösning (beredning före användning): Tillsätt DMSO till färskt medium, slutkoncentrationen är 5-10 %, blanda väl och ställ den i rumstemperatur för senare användning.
(3) Beroende på hur cellsubkulturen fungerar, samla in de odlade cellerna och ta en liten mängd cellsuspension (cirka 0,1 ml) för att räkna cellkoncentrationen och överlevnadshastigheten före frysning.
(4) Centrifugera, ta bort supernatanten, tillsätt en lämplig mängd kryokonserveringslösning för att göra cellkoncentrationen 1-5 x 106 celler/ml, blanda väl och fördela i det märkta kryokonserveringsröret, 1 ml/flaska, och ta en liten mängd cellsuspension för att detektera kontaminering.
(5) Kryokonserveringsmetod 1: Kryotuben placeras vid 4 oC i 10 minuter → -20 oC i 30 minuter → -80 oC i 16 till 18 timmar (eller över natten) → ångfas i tanken med flytande kväve för långtidslagring.
(6) Fryslagringsmetod 2: Frysröret placeras i en kylmaskin med konstant hastighet med ett inställt program och placeras sedan i en tank för flytande kväve.
英语
阿拉伯语
���ļ���